在传统医学的宝库中，中药一直以其独特的魅力和卓越的功效吸引着无数研究者的目光。其中，十全大补汤作为一款在东亚地区久负盛名的免疫增强配方，凭借其由十种药用植物巧妙组合而成的独特配方，在增强人体免疫功能方面发挥着重要作用，临床应用十分广泛。然而，长久以来，十全大补汤中究竟是哪些活性成分在发挥关键作用，一直是医学界亟待揭开的谜团。直到最近，一项突破性的研究为我们带来了新的曙光，让我们一同走进这场探寻十全大补汤“草本益生菌”奥秘的科学之旅。看它如何一步步揭开千年古方背后，那隐藏在共生、微生物与免疫之间的现代密码。

而这项为我们带来新曙光的研究，其思想源头，其实早在三十多年前就已悄然萌芽。它并非横空出世，而是一场跨越了时间的科学接力与验证。当现代实验室的精密仪器对准千年古方，一段关于“共生”、关于“微生物”、关于“传统智慧如何与现代科学对话”的精彩故事，才徐徐展开其核心篇章。这一切，要从一个在当年看似大胆、如今却被逐步证实的猜想说起。

日语原文出自：自然免疫制御技術研究組合丨关于LPS的研究介绍

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我们的研究小组曾于1992年发表论文，指出中药中含有大量的脂多糖，并推测中药的部分功效可能由脂多糖介导。这一观点在当时颇为新颖，因此并未引起广泛关注。然而近年来，陆续有研究报告表明，中药的某些效果确实取决于脂多糖。

在一份相关报告中，提及了自古以来广泛应用于癌症及丙型肝炎患者辅助治疗、以免疫活化效果著称的经典名方——十全大补汤。研究发现，其主要的活性成分之一，正是脂多糖。

十全大补汤由约十种草药组成，以其卓越的免疫激活功能、以及理想的安全性与有效性平衡而闻名。然而，其具体的有效成分始终未能完全明确。

研究者们注意到，十全大补汤对巨噬细胞（一种重要的免疫细胞）的激活作用与脂多糖极为相似。同时，考虑到十全大补汤中植物源性成分丰富，尤其是当归等药材中共存的微生物可能发挥关键作用，因此我们从“脂多糖或许是其有效成分之一”的视角展开了分析。

实验结果显示，十全大补汤所含的当归中，鉴定出多达519种微生物，并确实检测到含有脂多糖。当使用Polymyxin B去除这些脂多糖后，十全大补汤活化巨噬细胞的能力下降了约三分之一。进一步研究从当归中鉴定出12种以上的实际存在微生物，其中包含一些广泛存在于土壤和水体、能形成植物根际并促进植物生长的微生物拉恩氏菌属（Rahnella）。我们团队重点关注的一类泛菌属（Pantoea）微生物，也具有相似特征。

综合这些结果，研究作者认为：许多具有免疫激活效果的中药，其作用与药材中共存的微生物及其来源成分（如脂多糖）密切相关。从这一全新角度出发，重新审视和研究中药的有效成分，对于阐明其科学原理、推动现代化发展具有重要意义。

通过研究相关菌群，在“十全大补汤”中发现潜在的“草本益生菌”

十全大补汤（JTT）是一种由十种药用植物组成的免疫增强配方，在东亚地区临床用于增强人体免疫功能。JTT中的活性成分尚未明确，但现有证据表明，类脂多糖（LPS）样因子可能有助于其活性。为验证这一可能性，研究人员对JTT进行了包括高分辨率质谱分析在内的一系列检测，结果表明其中存在LPS的结构变体。这一发现为JTT可能含有免疫增强细菌提供了新线索。为初步探究JTT中的细菌特征，研究者对JTT中最具免疫刺激活性之一的药材当归（Angelica sinensis，干燥根）进行了16S核糖体RNA测序。测序结果显示，当归中共存在519个细菌属，其中丰度最高的拉恩氏菌属（Rahnella）广泛分布于水生环境和植物中。拉恩氏菌属的丰度与当归的免疫刺激活性相关。综上所述，本研究为“免疫增强草药的作用可能与其所含细菌相关”这一新兴理论提供了新的实证依据。

细菌无处不在。从炙热的沙漠到深邃的海沟，它们已适应地球生物圈的每一个角落¹⁻²。其中一些细菌获得了在其他生物体内生存的能力，形成互利共生（mutualism）、无害共栖（commensalism）或破坏性入侵寄生（parasitism）。那些定殖于植物内的细菌便属于此类。它们的存在早已为人所知，但直到近年来，随着强大的测序工具出现，才得以揭示独特的植物—微生物相互作用³⁻⁹。测序研究证实了人们长期以来的猜测：植物体内蕴藏着丰富多样的细菌群落。

植物体内多样微生物群落的发现，不仅在植物生物学领域意义重大，也对草药医学领域产生了重要影响。这意味着人类在服用药用植物的同时，也摄入了定殖其中的细菌。这些细菌对人体可能无害，带有毒性细菌的植物不会被选作草药。然而，它们是否影响草药的治疗效果？是否会产生对人体有益的分子？关于这些问题，近期对免疫增强草药紫锥菊（Echinacea）的研究提供了线索。Pasco 等人观察到，紫锥菊的细菌载量与其免疫刺激活性相关¹⁰。此外，用能去除革兰氏阴性菌脂多糖（LPSs）的多黏菌素B亲和树脂处理后，紫锥菊的活性显著下降¹¹⁻¹²。这些数据支持了“细菌在某些免疫增强草药中起作用”的观点。然而，该理论在其他研究中受到质疑。对Yamoa™（Funtumia elastica的磨碎树皮）¹³和巴西莓（Euterpe oleracea）果实¹⁴的研究则反驳了细菌的贡献，因为这些草药表现出不同于典型LPSs的免疫活性。

我们团队一直在研究十全大补汤（JTT），这是一种免疫增强型草本配方，在安全性与有效性之间达到了理想的平衡¹⁵。在东亚地区，JTT临床上被用于增强多种疾病患者的免疫功能，包括癌症¹⁶⁻¹⁷、丙型肝炎¹⁸及中耳炎¹⁹等。该配方由十种不同的草药混合而成（参见补充数据表S1）。由于其化学结构复杂，JTT中的活性成分尚未明确。

我们推测细菌可能参与JTT活性的作用，主要基于以下几点原因：首先，JTT已知具有“类LPS免疫刺激活性”²⁰⁻²¹；JTT与LPS均能在单核细胞中诱导相似的基因表达谱²²⁻²³。其次，JTT所含的多种组分草药为根部药材（表S1），这些根部药材在生长过程中直接与种类丰富的土壤细菌接触相互作用。第三，在我们近期对JTT筛选研究中，纯化出一种具有类LPS样活性的糖脂组分，该组分能有效刺激原代巨噬细胞和树突状细胞²²。这些活性并非源自大肠杆菌等常见细菌的污染，因为纯化组分并未表现出典型致病菌/肠道细菌的内毒素毒性²²。该活性的可能来源是植物定植细菌产生的LPS结构变体。

为探究细菌在十全大补汤（JTT）活性中作用机制，我们开展了一系列化学与生化研究。通过多粘菌素B处理等间接方法检测脂多糖（LPS）的存在，还采用质谱分析直接测定其分子式。此外，运用Illumina测序技术获取 JTT 中最具药效的成分——当归的内部细菌群落动态图谱信息。综合分析表明，这些结果支持了“植物细菌参与调控JTT药理活性作用”的观点。

多粘菌素B亲和树脂可消除JTT的免疫刺激活性：为探究细菌在十全大补汤（JTT）中可能的作用，我们首先使用多粘菌素B亲和树脂对JTT进行了处理²⁴。其原理在于，若活性来源于脂多糖（LPS），则该处理后能使其活性削弱。免疫刺激活性的检测，通过qRT-PCR分析THP-1单核细胞中细胞间粘附分子1（ICAM-1）的表达水平来实现；ICAM-1是单核细胞/巨噬细胞刺激的生物标志物²⁵⁻²⁶。

经模拟处理的 JTT（JTT 经链霉亲和素亲和树脂处理： JTT Mock）与未处理的 JTT 相比，诱导ICAM-1表达量达到DMSO对照组的近30倍（图1）。相比之下，经多粘菌素B处理的 JTT（JTT PmxB）诱导的 ICAM-1 水平显著降低（12 倍）（图1）。JTT PmxB的残留活性可能仍源于某些LPS变体，因为多粘菌素B仅能结合部分而非全部LPS²⁷。另一种可能是，该残留活性来自其他类别的分子，如皂苷²⁸⁻²⁹。无论如何，多粘菌素B实验的研究结果与“细菌参与JTT免疫刺激活性”的观点相一致。

图1.多粘菌素B处理可降低JTT活性。

从十全大补汤（JTT）中纯化出类脂质A（LA）样因子：接下来，我们按照方案1（Scheme 1）所示的流程对JTT进行了纯化。该流程基于从细菌培养物中纯化脂质A（LA）的成熟方案³⁰；LA是LPS中负责免疫刺激活性的部分（见补充数据图S1）。在此方案中，首先通过有机萃取去除疏水性脂质。LPS因其较大的多糖部分而进入水相。随后的酸水解作用将LA从多糖中释放出来；LA再被萃取至“LA富集”的有机层。因此，若JTT中存在LPS变体，其LA片段应出现在“LA富集”的有机层中（方案1中的红框部分）。

方案1.从 JTT 中富集类脂质酸（LA）因子的纯化方案。初始脱脂步骤已去除大部分脂质，而脂多糖（LPS）因分子量较大仍滞留于水相。将粗制LPS样品水解为脂酸（LAs），随后将所得LAs萃取至有机相，获得‘LA富集’样品（如红色方框所示）。

将十全大补汤（JTT）通过此流程处理，获得“LA富集”有机层，再进一步通过硅胶柱层析进一步分离。薄层色谱（TLC）分析显示，各组分出现多个斑点，其Rf值与LA一致（图2a）：在此展开条件下（CHCl₃/MeOH/H₂O/NH₄OH，40:25:4:2，v/v/v/v），LA通常出现在Rf值0.2至0.6的范围内³⁰。当这些组分进行免疫刺激活性测试时，其中多数能有效诱导单核细胞中ICAM-1的表达（图2b）。综上所述，这些结果表明我们的纯化方案从JTT中富集了类LA因子。

图2. JTT 中LA样因子的表征。

通过质谱法直接测定类LA样因子：上述结果间接支持了JTT中存在LPS变体，但缺乏分子证据。因此，我们采用高分辨率电喷雾电离质谱（HRESIMS）对纯化的类LA因子进行检测分析。脂质A（LA）通常具有磷酸化二葡糖胺结构并带有多个酰基链（如图S1所示），其分子量范围为1500至2500 Da（道尔顿），分子式通常含有2-4个氮原子及大量（>80个）碳原子。

对类脂质A（LA）因子进行HRESIMS分析，结果显示多种离子出现在LA典型分子量区间。其中包含对应分子式C₈₃H₁₄₅N₂O₂₃P（精确质量：1568.9976）和C₁₂₀H₂₁₇N₄O₃₈P（精确质量：2353.4908）的离子（分别为图3中的化合物1和化合物2）；观测到的离子汇总于补充数据表S2。这些分子式与LA的基本结构骨架相符（图S1）。但在SciFinder数据库中已知的LAs并未完全匹配。由此推测，所纯化的因子可能是脂质A的结构变体。据我们所知，本研究首次为免疫增强草药中存在LPS变体提供了直接的分子证据。

在当归中检测到植物定植变形菌：我们的研究结果表明，具有免疫增强作用的细菌有助于 JTT的活性。尽管部分植物中的细菌群落已有研究³⁻⁹，但关于JTT中所含细菌的信息了解仍十分有限。为率先解析JTT中的细菌群落特征，我们对当归进行了初步的宏基因组分析，当归是JTT中免疫刺激作用最强的药材之一（图S2）。为表征细菌多样性及其变异性，本研究检测了三份当归（干燥根）样本。

从三份样本中提取DNA，并对16S核糖体RNA（16S rRNA）基因进行PCR扩增；该基因是微生物分类中广泛使用的系统发育标记³¹。本研究检测了三对PCR引物：P1(fM1/rC5)³²、P2(926f/1392r)⁴和P3(1114f/1392r)⁴，这些引物均用于在植物DNA存在条件下扩增原核生物16S rRNA。三对引物均获得预期大小的PCR扩增产物（图S3）。扩增产物经Illumina MiSeq测序，获得高质量读段（72.1%的读段质量评分≥30；见图S4）。测序结果显示，其中两对引物（P1和P2）主要扩增当归中的叶绿体和线粒体DNA，而P3则揭示了当归中复杂的细菌群落（门：21，纲：59，目：108，科：219，属：519）（图4a）。不同样本间的细菌群落存在显著差异（图4b），但拉恩氏菌属（Rahnella）在所有三个样本中均为最丰富菌属（图4c）。拉恩氏菌属是广泛分布于水生环境和植物中的革兰氏阴性菌³³–³⁵。值得注意的是，当归样本中拉恩氏菌属的相对丰度（%）与其免疫刺激活性呈正相关趋势（图4c）。

图4. 当归的宏基因组分析。

本研究支持了“草药免疫增强作用中细菌具有重要贡献”这一新兴理论¹⁰⁻¹²。该理论认为，草药本身未必直接产生免疫刺激物，而是富集了具有免疫增强活性的有益细菌——我们称之为“草本益生菌”。在草药医学发展历程中，人类或许早已在不知不觉中受益于这些草药益生菌。尽管已知某些免疫增强草药已被证实可产生免疫刺激物（例如皂树产生的QS21皂苷²⁸⁻²⁹），但许多草药的活性因子仍缺乏明确表征。若这些因子来自植物定植细菌的LPS变体，则因其含量极微且隐匿于大量植物源化合物（如糖脂和碳水化合物）之中而难以识别。此外，植物中的LPS变体是由多种植物定植细菌组成的异质性混合物。除非如本研究所示进行特异性检测分析，否则很难察觉到它们在草药中的存在。因此，细菌对草药活性的贡献可能比目前所认知的更为普遍。

我们初步的16S宏基因组研究揭示了当归内部复杂的细菌群落。其中多数为革兰氏阴性菌，这与我们在JTT中观察到的类脂质A（LA）免疫刺激因子特征相一致。不同样本的细菌群落构成存在差异，其免疫刺激活性也有所不同。值得注意的是，拉恩氏菌属（Rahnella）在所有三个样本中均呈现高丰度，且与活性相关。该菌属广泛分布于水体、土壤及植物根际³⁶。该属中许多菌株已知具有促进植物生长作用的根际细菌活性³⁷–³⁹。本研究提出了一种可能性：某些拉恩氏菌物种在当归中富集，并对其免疫刺激活性作出贡献。目前我们正在进一步开展研究，以系统解析当归及JTT其他草药中的细菌组成。

综上所述，本研究首次通过质谱证据证实免疫增强草药中存在LPS变体，并首次完成了当归的宏基因组解析。这些结果支持了“植物定植细菌对十全大补汤（JTT）活性具有贡献”的观点，尽管仍需进一步研究以明确相关细菌群落的免疫学特性。本研究为揭示‘草本益生菌’在JTT乃至其他免疫增强草药中以往被忽视的作用奠定了基础。

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